کیت Real‑Time PCR SYBR Green یک ابزار دقیق و شناخته شده برای اندازه گیری کمّی اسید نوکلئیک در آزمایشگاه های تحقیقاتی است که بر اساس روش Real‑Time PCR یا qPCR با استفاده از رنگ SYBR Green I طراحی شده است. در این روش، دای ان ای دو رشته ای (dsDNA) که در طی هر چرخه PCR تشکیل می شود، با رنگ SYBR Green پیوند می یابد و این اتصال باعث افزایش سیگنال فلورسانس می شود، به طوری که مقدار سیگنال مستقیماً با مقدار محصول تکثیرشده در هر چرخه مرتبط است و به همین دلیل امکان کمّی سازی دقیق نمونه فراهم می آید. SYBR Green یک رنگ dsDNA‑بایندینگ اقتصادی است که برخلاف روش های مبتنی بر پروب نیازی به طراحی پروب اختصاصی ندارد و برای شمار زیادی از هدف ها در تحقیقات ژن بیان، ژنوتایپینگ و سنجش تعداد نسخه مناسب است. در پایان واکنش، اغلب تحلیل منحنی ذوب (Melt Curve) انجام می گیرد تا از وجود محصول تکثیرشده ی خاص و عدم تشکیل محصولات غیرهدف اطمینان حاصل شود. کیت های SYBR Green شامل مسترمیکس های آماده بافر، رنگ فلورسانت، آنزیم های Hot‑Start Taq DNA Polymerase و همه اجزای لازم دیگر هستند که با اکثر سیستم های Real‑Time PCR سازگار می باشند.

کاربردهای کیت Real‑Time PCR SYBR Green

• اندازه گیری کمّی بیان ژن ها در نمونه های مختلف بیولوژیک
• تحلیل های ژنوتایپینگ و بررسی خانواده های ژنی
• کمّی سازی بار ویروسی یا تعداد نسخه های هدف در نمونه های مولکولی
• کلونینگ و بررسی موفقیت تکثیر توالی های نوترکیب
• مطالعات بیوانفورماتیک و شناسایی الگوهای بیان ژنی در شرایط تجربی

مشخصات فنی معمولی کیت Real-Time PCR سایبر گرین

• نوع تکنیک: Real‑Time Quantitative PCR (qPCR)
• رنگ فلورسانت: SYBR Green I برای اتصال به dsDNA
• آنتی بادی Hot‑Start: آنزیم فعال شونده برای افزایش اختصاصیت
• قابلیت دستگاه: سازگار با اکثر سیستم های Real‑Time PCR استاندارد
• دامنه دینامیک: قابل اندازه گیری گستره وسیعی از مقادیر هدف
• تحلیل ذوب: امکان اجرای منحنی ذوب برای تشخیص محصول خاص
• واحد واکنش: بسته به فرمت، مثلاً 20–25 µL در هر چاهک
• شرایط نگهداری: اغلب در دمای منفی ۲۰ °C نگهداری می شود با اجتناب از چرخه های متعدد انجماد و ذوب

پروتکل عملی (نحوه استفاده) کیت Real-Time PCR سایبر گرین

مراحل معمول اجرای Real‑Time PCR با کیت SYBR Green:

• ۱. آماده سازی واکنش: در یک میکروپلیت یا تیوب مناسب، مقدار مشخص 2× SYBR Green Master Mix را به همراه پرایمرهای فوروارد و ریورس، DNA یا cDNA نمونه و آب فاقد نوکلئاز اضافه کنید تا حجم نهایی برسد.
• ۲. تنظیم برنامه ترمال: برنامه دستگاه را برای Denaturation اولیه، سپس چرخه های پی درپی دناچوراسیون، آنیلینگ و الحاق DNA در شرایط مناسب تنظیم کنید. معمولاً بین 35–45 چرخه اجرا می شود.
• ۳. اندازه گیری Real‑Time: در هر چرخه، سیگنال فلورسانس SYBR Green اندازه گیری می شود تا مقدار dsDNA تولیدشده تعیین گردد.
• ۴. تحلیل منحنی ذوب (Melt Curve): پس از تکمیل چرخه ها، با افزایش تدریجی دما منحنی ذوب تهیه کنید تا از تک محصولی بودن واکنش اطمینان حاصل شود.
• ۵. تحلیل داده ها: بر اساس نقاط آستانه (Ct) و منحنی استاندارد، مقدار ژن هدف در نمونه ها تحلیل می شود.

مزایا و نکات کلیدی کیت Real-Time PCR سایبر گرین

• سازگاری بالا با طیف گسترده ای از سیستم های Real‑Time PCR
• امکان استفاده در تحقیقات بیان ژن و سنجش مقادیر نسبی یا مطلق
• تحلیل منحنی ذوب برای تمایز محصول هدف از محصولات غیرهدف
• عدم نیاز به طراحی پروب های اختصاصی برای هر هدف که هزینه و زمان را کاهش می دهد
• کنترل دقت و صحت نتایج با استفاده از نمونه های کنترل مثبت و منفی

نکات کاربردی کیت Real-Time PCR سایبر گرین در آزمایشگاه

• از پرایمرهای بهینه شده با بازده مناسب برای افزایش اختصاصیت استفاده کنید.
• کنترل منفی (بدون الگو) را در هر پلیت قرار دهید تا آلودگی تشخیص داده شود.
• اجزا را روی یخ یا در دمای پایین تهیه کنید تا اثر آنزیم های Hot‑Start بهینه حفظ شود.
• پس از تکمیل، منحنی ذوب واضح و یک پیک تنها نشان دهنده محصول خاص است.