کیت تست مایکوپلاسما مبتنی بر PCR (واکنش زنجیره ای پلی مراز)، یک ابزار تشخیصی سریع، حساس و اختصاصی برای شناسایی آلودگی های مخرب با مایکوپلاسما در محیط های کشت سلولی است. این کیت ها با تکثیر اختصاصی توالی های DNA مختص مایکوپلاسما، امکان تشخیص زودهنگام و مطمئن این آلودگی شایع را فراهم می کنند.

مکانیسم، طراحی و اجزای کلیدی کیت تست مایکوپلاسما

• اصل تشخیص (Detection Principle): این کیت ها از تکنیک PCR معمولی یا Real-Time PCR (qPCR) استفاده می کنند.
  • PCR معمولی (Endpoint PCR): پس از تکثیر، محصولات روی ژل آگاروز الکتروفورز شده و باندهای DNA قابل مشاهده می شوند.
  • Real-Time PCR (qPCR): استاندارد طلایی فعلی. اجازه می دهد تکثیر DNA در حین چرخه های PCR به صورت لحظه ای و کمی (Quantitative) ردیابی شود. سریع تر است، خطر آلودگی متقاطع پس از PCR را کاهش می دهد و اغلب حساسیت بالاتری دارد.
• هدف های ژنومی (Genomic Targets): پرایمرهای طراحی شده در کیت، توالی های حفاظت شده و اختصاصی ژن های رایج مایکوپلاسما را هدف می گیرند، مانند:
  • ژن rRNA 16S
  • ژن rRNA 23S
  • ژن فاکتور طولانی شدن Tu (tuf)
• اجزای معمول کیت (Typical Kit Components):
  • میکس PCR اختصاصی (Specific PCR Mix): شامل DNA پلی مراز مقاوم به حرارت (مانند Taq پلی مراز)، dNTPها، بافر، و پرایمرهای اختصاصی مایکوپلاسما (گاهی چندگانه برای تشخیص طیف وسیعی از گونه ها).
  • کنترل های مثبت و منفی (Positive & Negative Controls):
    • کنترل مثبت (PC): حاوی مقدار مشخصی از DNA مایکوپلاسما برای تأیید عملکرد صحیح کیت.
    • کنترل منفی (NC): معمولاً آب فاقد DNA/RNA (Nuclease-Free Water) برای تشخیص آلودگی در مواد یا فرآیند کار.
  • کنترل داخلی (Internal Control - IC): (در کیت های پیشرفته) یک توالی DNA غیر مرتبط که توسط مجموعه پرایمر جداگانه ای تکثیر می شود. وجود آن در نمونه، تأیید می کند که فرآیند استخراج و PCR به درستی انجام شده و نتیجه منفی، واقعاً منفی است (نه به دلیل وجود مهارکننده های PCR).
  • محلول های مورد نیاز جداگانه (Optional Separate Solutions): ممکن است شامل محلول استخراج DNA ساده برای نمونه های محیط کشت باشد.

مزایا کیت تست مایکوپلاسما نسبت به روش های سنتی

• حساسیت بسیار بالا (Very High Sensitivity): قادر به تشخیص تعداد بسیار کم باکتری (حتی کمتر از ۱۰ CFU در میلی لیتر).
• سرعت (Speed): نتیجه در چند ساعت (معمولاً ۲-۴ ساعت) در مقایسه با چند روز یا هفته برای روش کشت میکروبی.
• اختصاصی بودن (Specificity): برخلاف روش هایی مانند فلورسنت (Hoechst) که همه آلودگی های باکتریایی و قارچی را نشان می دهند، PCR تنها مایکوپلاسما را تشخیص می دهد.
• قابلیت کمی سازی (Quantification): در روش qPCR، می توان بار آلودگی را تخمین زد.
• عدم نیاز به کشت مایکوپلاسما (No Need for Mycoplasma Culture): مایکوپلاسما رشد بسیار کندی دارد و کشت آن مشکل است.

کاربردهای اصلی کیت تست مایکوپلاسما

• پایش منظم سلامت بانک سلولی (Routine Cell Bank Monitoring): تست های دوره ای (مثلاً ماهانه) برای اطمینان از عاری بودن کشت های سلولی با ارزش از مایکوپلاسما.
• تست قبل از انجماد سلول (Pre-freezing Testing): اطمینان از سالم بودن سلول ها قبل از فرآیند بانک سلولی.
• تست هنگام دریافت سلول جدید (Incoming Cell Line Testing): بررسی سلول های دریافتی از بانک های سلولی یا آزمایشگاه های دیگر.
• عیب یابی مشکلات کشت سلول (Troubleshooting Cell Culture Problems): هنگامی که سلول ها رشد غیرعادی، تغییر مورفولوژی یا مرگ سلولی نشان می دهند.
• تأیید خلوص محصولات بیولوژیک (Purity Testing of Biological Products): برای واکسن ها، محصولات تراپیوتیک یا ویروس های تولید شده در سیستم های کشت سلولی.

نکات حیاتی برای انتخاب، اجرا و تفسیر نتایج کیت تست مایکوپلاسما

• انتخاب کیت با طیف تشخیصی مناسب (Selecting a Kit with Appropriate Spectrum): اطمینان از اینکه کیت، گونه های شایع مایکوپلاسما در کشت سلولی را پوشش می دهد (معمولاً: M. orale, M. arginini, M. hyorhinis, M. fermentans, M. hominis, M. pneumoniae, A. laidlawii).
• آماده سازی نمونه صحیح (Proper Sample Preparation):
  • نوع نمونه: محیط کشت سلولی (ترجیحاً ۲۴-۷۲ ساعت پس از آخرین تعویض محیط، زمانی که سلول ها در حالت رشد نمایی هستند) یا لیزشده سلول.
  • حجم نمونه کافی: معمولاً ۱۰۰ میکرولیتر تا ۱ میلی لیتر.
  • استخراج DNA با کیفیت: ممکن است نیاز به یک مرحله ساده لیز (با استفاده از معرف موجود در کیت یا روش گرمایی) باشد. برای حساسیت بیشتر، استفاده از کیت استخراج DNA تجاری توصیه می شود.
  • برای نمونه های حاوی سرم، ممکن است نیاز به تیمار اضافی برای حذف مهارکننده های PCR باشد.
• اجرای دقیق کنترل ها (Rigorous Use of Controls):
  • اجرای همزمان کنترل مثبت، منفی و کنترل داخلی (در صورت وجود) در هر ران PCR.
  • استفاده از کنترل استخراج (Extraction Control) که در آن آب به جای نمونه، تحت فرآیند استخراج قرار می گیرد.
• پیشگیری از آلودگی متقاطع (Prevention of Cross-Contamination):
  • انجام مراحل آماده سازی نمونه، استخراج DNA و مخلوط کردن واکنش PCR در محیط جداگانه و تحت هود لامینار.
  • استفاده از نوک پیپت های فیلتردار.
  • جداسازی فیزیکی مناطق پیش از PCR و پس از PCR.
• تفسیر نتایج (Interpretation of Results):
  • qPCR: نمونه ای که سیگنال آن زودتر از آستانه تعیین شده (Ct value پایین) به سطح آستانه می رسد، مثبت محسوب می شود. کنترل داخلی باید در تمام نمونه ها (از جمله منفی) مثبت باشد.
  • PCR معمولی: مشاهده باند در اندازه مورد انتظار در ژل، نشانه مثبت است. باید با کنترل مثبت مقایسه شود.
  • نتیجه مثبت کاذب می تواند ناشی از آلودگی باشد. نتیجه منفی کاذب می تواند ناشی از وجود مهارکننده ها یا شکست در استخراج DNA باشد (که کنترل داخلی آن را نشان می دهد).
• فرکانس تست (Testing Frequency): توصیه استاندارد، تست سلول های در حال کشت فعال ماهانه یکبار و تست تمام بانک های سلولی اصلی و کاری است.
• اقدام پس از تشخیص مثبت (Action upon Positive Result):
  • دور ریختن فوری کشت آلوده (اگر ارزشمند نیست).
  • درمان با آنتی بیوتیک های خاص ضد مایکوپلاسما (مانند پلوروموتیل/BM-سیکلین) در صورت امکان، و سپس تأیید حذف آلودگی با تکرار تست.
  • ضدعفونی کامل انکوباتور، هود و تجهیزات.
  • تست تمام کشت های سلولی دیگر در آزمایشگاه.

کیت تست مایکوپلاسما مبتنی بر PCR یک جزء ضروری از برنامه تضمین کیفیت در هر آزمایشگاه کشت سلولی مدرن است. اجرای منظم و صحیح این تست، از یکپارچگی تحقیقات، سلامت بانک سلولی و اعتبار داده های تولیدشده محافظت می کند.