هپاتوسیت های اولیه موش، سلول های پارانشیمال جدا شده مستقیماً از کبد موش هستند که عملکردهای متابولیک، سنتزی و سم زدایی اختصاصی خود را برای مدت محدودی در کشت حفظ می کنند. این سلول ها به دلیل حفظ فنوتیپ تمایزیافته تر نسبت به خطوط سلولی جاودانه، مدل طلایی و با ارزشی برای مطالعات سم شناسی کبدی، متابولیسم دارو، بیماری های کبدی (مانند استئاتوهپاتیت، فیبروز)، بیولوژی ویروس هپاتیت و متابولیسم لیپید/گلوکز محسوب می شوند.

ویژگی های سلولی و چالش های کشت اولیه کبد موش

• فنوتیپ و عملکردهای کلیدی حفظ شده در کشت کوتاه مدت:
  • بیان سطحی و فعالیت آنزیم های سیتوکروم P450 (CYP450) کلید متابولیسم دارو.
  • سنتز و ترشح پروتئین های پلاسما مانند آلبومین و فیبرینوژن.
  • ذخیره گلیکوژن و متابولیسم گلوکز.
  • متابولیسم لیپیدها و کلسترول.
  • حساسیت به آسیب سمیت کبدی (هپاتوتوکسیسیتی).
• چالش اصلی: از دست دادن سریع فنوتیپ تمایزیافته (Rapid Dedifferentiation):
  • پس از جداسازی و در کشت معمولی دو بعدی، هپاتوسیت ها به سرعت (طی ۲۴-۷۲ ساعت) شروع به از دست دادن عملکردهای تخصصی خود می کنند (مانند کاهش شدید بیان CYP450 و سنتز آلبومین).
  • این امر پنجره زمانی آزمایشات را محدود می کند و نیاز به محیط ها و تکنیک های کشت تخصصی برای حفظ عملکرد دارد.
• مورفولوژی در کشت: پس از کشت، به سلول هایی با سیتوپلاسم گسترده و هسته گرد تبدیل می شوند و اغلب دوباره سازمان دهی می شوند تا جزایر سلولی (Islands) تشکیل دهند.

روش های اصلی جداسازی کشت اولیه کبد موش (روش استاندارد)

• روش پرفیوژن دو مرحله ای کلاژناز (Two-Step Collagenase Perfusion): روش استاندارد طلایی برای جداسازی با بازده و حیات بالا.
  • مرحله اول (پرفیوژن با ماده کلاته کننده): شستشوی عروق کبد با بافر بدون کلسیم/منیزیم (مانند EGTA) برای تجزیه ارتباطات بین سلولی.
  • مرحله دوم (پرفیوژن با کلاژناز): هضم ماتریکس خارج سلولی با کلاژناز برای آزاد کردن هپاتوسیت ها.
  • این روش نیازمند مهارت جراحی، پمپ پرفیوژن و انجام سریع کار است.
• روش های ساده تر (برای مواقعی که پرفیوژن ممکن نیست):
  • هضم آنزیمی مستقیم بافت (Direct Enzymatic Digestion): خرد کردن مکانیکی کبد و سپس هضم با کلاژناز/تریپسین. بازده و کیفیت پایین تر.

کاربردهای اصلی کشت اولیه کبد موش در تحقیقات

• مطالعات سم شناسی کبدی و متابولیسم دارو (Hepatotoxicology & Drug Metabolism):
  • ارزیابی سمیت مستقیم داروها و مواد شیمیایی (Cytotoxicity).
  • مطالعه متابولیسم فاز I و II، تعیین نیمه عمر دارو و شناسایی متابولیت ها.
  • بررسی القای یا مهار آنزیم های CYP450.
• مدل سازی بیماری کبد چرب غیرالکلی (NAFLD/NASH Modeling): القای استئاتوز (تجمع چربی) در هپاتوسیت ها با اسیدهای چرب آزاد (مانند اولئات/پالمیتات) برای مطالعه مکانیسم های بیماری و غربالگری دارو.
• مطالعات ویروس هپاتیت B و C (Hepatitis B/C Virus Studies): اگرچه موش میزبان طبیعی نیست، اما از هپاتوسیت های اولیه برای مطالعه چرخه ویروس در شرایط خاص استفاده می شود.
• تحقیقات فیبروز کبدی (Liver Fibrosis Research): مطالعه فعال شدن هپاتوسیت ها به وضعیت پرو-فیبروتیک یا پاسخ آن ها به محرک های التهابی.
• متابولیسم انرژی و دیابت (Energy Metabolism & Diabetes): بررسی گلوکونئوژنز، گلیکولیز و سنتز لیپید.
• غربالگری اولیه داروهای هپاتوپروتکتور (Hepatoprotective Drug Screening): تست ترکیبات محافظت کننده در برابر سموم شناخته شده (مانند استامینوفن، الکل).

نکات حیاتی برای کشت اولیه کبد موش موفق و آزمایش های معتبر

• انتخاب و آماده سازی بستر کشت (Coating): هپاتوسیت ها برای چسبندگی و بقا نیاز به بستری با ماتریکس خارج سلولی دارند. کلاژن نوع I (گاوی یا موش صحرایی) یا ماتریژل (Matrigel) استاندارد طلایی است.
• محیط کشت تخصصی (Specialized Culture Media):
  • محیط پایه: William's E Medium یا DMEM با قند بالا.
  مکمل های ضروری: انسولین، هیدروکورتیزون (یا دگزامتازون) برای حفظ تمایز، نیکوتینامید، سرم (معمولاً ۵-۱۰٪ FBS)، و گاهی تری-یدوتیرونین.
  • استفاده از محیط های بدون سرم (Serum-Free) برای آزمایش های متابولیسم دارو، برای حذف تداخل فاکتورهای سرم.
• کشت کو-کالچر (Co-culture): کشت همزمان هپاتوسیت ها با سلول های غیرپارانشیمال کبدی (مانند سلول های ستاره ای کبدی یا سلول های اندوتلیال سینوزوئیدی) می تواند به حفظ طولانی تر فنوتیپ کمک کند.
• کشت سه بعدی (۳D Culture): کشت هپاتوسیت ها به صورت آگرگات اسفروئیدی (Spheroids) یا در داربست های سه بعدی، عملکرد و بقای آن ها را برای هفته ها (نه روزها) حفظ می کند. این روش در حال تبدیل شدن به استاندارد جدید است.
• زمان بندی آزمایش ها (Timing of Experiments): بیشتر آزمایشات عملکردی (مانند تست سمیت یا متابولیسم) باید در طی ۲۴-۴۸ ساعت اول پس از کشت انجام شوند، زمانی که سلول ها بیشترین تمایز را حفظ کرده اند.
• کنترل کیفیت جداسازی (Quality Control of Isolation):
  • بررسی حیات سلولی (Viability): با تریپان بلو بلافاصله پس از جداسازی. حیات بالای ۸۰-۸۵٪ برای اکثر آزمایشات لازم است.
  • بررسی خلوص و مورفولوژی: هپاتوسیت ها سلول های بزرگ با یک یا دو هسته هستند.
• ذخیره و استفاده (Storage & Use): هپاتوسیت های اولیه قابل انجماد و احیای مؤثر نیستند. معمولاً باید بلافاصله پس از جداسازی استفاده شوند، بنابراین برنامه ریزی دقیق آزمایش ضروری است.
• آزمایش های عملکردی (Functional Assays):
  • سمیت سلولی (Cytotoxicity): LDH release، MTT، ATP.
  • متابولیسم دارو: تست فعالیت CYP450 (مانند تست EROD برای CYP1A)، اندازه گیری نرخ مصرف دارو.
  • سنتز آلبومین/اوره: الایزا یا تست رنگ سنجی.
  • تجمع چربی (استئاتوز): رنگ آمیزی Oil Red O.
• ملاحظات اخلاقی و 3R: با توجه به نیاز به کشتن یک موش برای هر آزمایش، باید از تعداد حیوانات بهینه استفاده کرد و طرح آزمایش به گونه ای باشد که حداکثر اطلاعات از هر جداسازی به دست آید.

کشت اولیه هپاتوسیت های موش، با وجود چالش های فنی، ابزاری بی بدیل برای مطالعات فیزیولوژیکی و پاتولوژیک مرتبط با کبد است. پیشرفت در روش های کشت سه بعدی و کو-کالچر پنجره زمانی و قابلیت اعتماد این مدل ارزشمند را به طور قابل توجهی افزایش داده است.