محیط کشت گامبرگ B5 یک محیط کشت پایه تخصصی و پرکاربرد در کشت بافت گیاهی است که در سال ۱۹۶۸ توسط O.L. Gamborg و همکارانش طراحی شد. این محیط به طور خاص برای کشت سوسپانسیون سلولی و پروتوپلاست گیاهان دولپه ای، به ویژه خانواده بقولات (Fabaceae) مانند سویا، یونجه و لوبیا توسعه یافت. B5 به دلیل غلظت پایین تر نیترات و نسبت متفاوت نیترات به آمونیوم در مقایسه با محیط MS، برای بسیاری از کشت های سوسپانسیونی و همچنین کشت کالوس برخی گونه ها ترجیح داده می شود.

ترکیبات، فرمولاسیون و نقاط تمایز کلیدی محیط کشت B5 - گامبورگ (در مقایسه با MS):

• نمک های ماکرو (Macro Salt Formulation): مهم ترین وجه تمایز B5 از MS است.
  • نیتروژن پایین تر: غلظت کل نیتروژن در B5 (حدود ۲۷ میلی مولار) به مراتب کمتر از MS (حدود ۶۰ میلی مولار) است. این از تجمع زیاد آمونیوم که می تواند برای رشد برخی سلول ها در سوسپانسیون سمی باشد، جلوگیری می کند.
  • منبع نیتروژن: عمدتاً از نیترات پتاسیم (KNO3) تأمین می شود و مقدار آمونیوم (از (NH4)2SO4) بسیار ناچیز است. این نسبت برای کشت های سوسپانسیونی که حساسیت بیشتری به آمونیوم دارند، مناسب تر است.
  • فسفر بالاتر: غلظت فسفات (NaH2PO4.H2O) در B5 بالاتر است که ممکن است برای متابولیسم سلولی در شرایط کشت مایع مفید باشد.
• نمک های میکرو (Microelements): فرمول میکروالمنت B5 کاملاً متفاوت و غنی تر از MS است. حاوی کبالت (Co)، مس (Cu)، مولیبدن (Mo)، ید (I) و روی (Zn) به صورت کمپلکس با EDTA است که پایداری و در دسترس بودن این عناصر را افزایش می دهد. این ترکیب برای رشد طولانی مدت سوسپانسیون سلولی بهینه شده است.
• ویتامین ها و آلی های آلی (Vitamins & Organics):
  • دارای طیف کاملی از ویتامین ها است، از جمله: تیامین (B1)، نیاسین (B3)، پیریدوکسین (B6)، پانتوتنات کلسیم (B5) و بیوتین (B7) که در محیط MS وجود ندارد. این غنای ویتامینی برای رشد سلول های منفرد در سوسپانسیون بسیار حیاتی است.
  • مایواینوزیتول (Myo-inositol) نیز به مقدار کافی وجود دارد.
• ساکارز (Sucrose): مانند MS، معمولاً با غلظت ۲۰-۳۰ گرم در لیتر (۲-۳٪) استفاده می شود.

کاربردهای اصلی و تخصصی محیط کشت B5 - گامبورگ (Keywords Researchers Use):

• کشت سوسپانسیون سلولی (Cell Suspension Culture): محیط انتخابی برای ایجاد و نگهداری خطوط سوسپانسیون سلولی با رشد سریع و یکنواخت، به ویژه برای گیاهانی مانند سویا (Glycine max)، هویج و تنباکو.
• کشت پروتوپلاست و آگلومره شدن (Protoplast Culture & Aggregation): فرمول نمکی و ویتامینی B5 برای بازسازی دیواره سلولی و تقسیم سلول های پروتوپلاست شده بسیار مناسب گزارش شده است.
• کشت کالوس (Callus Culture): برای القا و نگهداری کالوس برخی گونه ها، به ویژه گونه هایی که به غلظت بالای نمک های MS حساس هستند یا کالوس های نرم و شکننده (Friable Callus) که مناسب شروع کشت سوسپانسیون هستند.
• مطالعات متابولیت های ثانویه (Secondary Metabolite Studies): به دلیل پشتیبانی خوب از رشد سوسپانسیون سلولی، برای تولید و استخراج ترکیبات ارزشمندی مانند فیتواستروژن ها، آلکالوئیدها و آنتی اکسیدان ها در بیوراکتورها استفاده می شود.
• تبدیل با آگروباکتریوم و بیان ژن موقت (Agrobacterium Transformation & Transient Expression): اغلب از محیط B5 مایع یا نیمه جامد برای کشت هم زمان برگ یا قطعات برگی با آگروباکتریوم در پروتکل های تراریختی استفاده می شود.

نکات حیاتی برای تهیه، انتخاب و بهینه سازی محیط کشت B5 - گامبورگ:

• انتخاب بین MS و B5: قانون کلی: اگر محیط استاندارد برای گونه گیاهی شما مشخص نیست، برای ریزازدیادی و باززایی ساقه/ریشه از MS و برای کشت سوسپانسیون سلولی و کار با پروتوپلاست از B5 شروع کنید. آزمایش اولیه هر دو محیط توصیه می شود.
• تهیه و استریلیزاسیون (Preparation & Sterilization):
  • به دلیل وجود EDTA در محلول استوک میکروالمنت ها، ممکن است رسوب ایجاد شود. گرم کردن ملایم و تکان دادن محلول قبل از استفاده می تواند کمک کننده باشد.
  • مانند MS، هورمون های گیاهی و ویتامین های حساس به حرارت (مانند تیامین، بیوتین) باید پس از اتوکلاو و خنک شدن محیط، به صورت استریل فیلتر شده اضافه شوند.
  • pH بهینه معمولاً بین ۵.۵ تا ۵.۸ (قبل از جامدسازی) است.
• اصلاحات رایج (Common Modifications):
  • B5 بدون هورمون (Hormone-Free B5): به عنوان پایه برای اضافه کردن هورمون های مورد نیاز.
  • B5 با ویتامین های کم (B5 with Reduced Vitamins): برخی از گونه ها ممکن است به تمام ویتامین های B5 نیاز نداشته باشند.
  • اضافه کردن کازئین هیدرولیزات یا مخمر استخراج (Casein Hydrolysate / Yeast Extract): برای افزایش رشد در کشت های سوسپانسیونی دشوار.
• جامدسازی (Solidifying Agent): برای محیط جامد از آگار (۶-۸ گرم در لیتر) استفاده می شود. برای کار با پروتوپلاست، از آگار با درجه خلوص بسیار بالا یا از محیط مایع استفاده می شود.
• شرایط نگهداری (Storage Conditions): محلول های استوک غلیظ (خصوصاً میکروالمنت های حاوی EDTA) در یخچال و در ظروف تیره نگهداری شوند. محیط آماده نیز مانند MS محدودیت زمانی دارد (۲-۴ هفته در یخچال).

محیط کشت B5 با طراحی هوشمندانه خود، نیازهای خاص کشت های سلولی در فاز مایع را به خوبی برطرف می کند. درک تفاوت های بنیادی آن با محیط MS، محقق را در انتخاب محیط پایه صحیح برای دستیابی به رشد بهینه و اهداف آزمایشگاهی یاری می رساند.